بر بيان آنزيم ترانس آميناز در فاز محلول IPTG بررسي تاثير دما و غلظت باكتري اشرشيا كلي

خلاصه فارسی

مقدمه: ترانس آمينازها آنزيمهاي وابسته به پريدوكسال '5 -فسفات بوده كه يك گروه آمين را از مولكول دهنده به مولكول پذيرنده انتقال ميدهند. بنابراين اين آنزيم ها نقش مهمـي در سـنتز زيسـتي تركيبات حاوي آمين كايرال و آمينو اسيدها ايفا ميكنند. جداسازي پروتئين ها از فاز نامحلول بـاكتري باعث كم شدن عملكرد پروتئين و كاهش بازده خالص سـازي مـيشـود. در نتيجـه توليـد آنـزيم بـه صورت محلول در coli.E گامي مهم در فرآيند توليد زيستي است. هدف از اين مطالعـه ارزيـابي اثـر غلظتهاي مختلف IPGT، چاپرونهاي مولكولي و دما بر بيان آنزيم ترانس آميناز نوتركيـب در فـاز محلول است. روشكار: در اين مطالعه، ژن جهش يافته آنزيم ترانس آمينـاز بـا اسـتفاده از هضـم آنـزيم هـاي محدود الاثر HindIII و BamHI و آنزيمDNA T4 ليگاز درون وكتور PET28b وارد گرديد. وكتـور نوتركيب توسط روش كلريد كلسيم و شوك حرارتـي بـه داخـل بـاكتريDh5α coli.E منتقـل شـد. سپس PCR-Colony براي تاييد درستي فرآيند كلونينگ و وجود ژن مورد نظـر در سـاختار پلاسـميد انجام شد. به منظور بيان پروتئين وكتور PET28b حاوي پروتيين هدف به سـلولهـاي BL21 coli.E منتقل شد. با استفاده از روش برادفورد غلظت پروتئين محاسبه شـده و ميـزان بيـان پـروتئين تـرانس آميناز محلول توسط PAGE – SDS مورد بررسي قرار گرفت. در مرحله بعد به منظور افـزايش بيـان پروتئين ترانس آميناز در فاز محلول اثرفاكتورهاي دما، غلظـتهـاي مختلـف IPTG و مولكـولهـاي شيميايي (سوربيتول، آرژنين، سوكروز، گلايسين و توئين) بررسي شد. نتايج: بررسي نتايج PCR-Colony روي ژل آگارز وجود ژن تـرانس آمينـاز را در بـاكتريهـاي ترانسفورم شده تاييد كرد. بررسي بيان كلونيهاي مختلف نشان داد بيان پـروتئين در كلـوني يـك در چكيده فارسي II مقايسه با ساير كلونيها به صورت معناداري بيشتر بود. بنابراين، اين كلـوني بـراي آزمايشـات بعـدي انتخاب گرديد. بررسي اثر دما و غلظت IPTG بر بيان پروتئين نشان داد تاثير دما بر بيان آنزيم ترانس آميناز بيش تر از IPTG است و بيش ترين بيان پروتئين 2 ساعت بعد از القاي بيان در دماي 37 درجه سانتي گراد و غلظت 1 ميلي مولار از IPTG انجام ميشود. نتايج اين مطالعه نشان داد كـه سـوربيتول در مقايسه با ساير تركيبات مورد استفاده در اين تحقيق به طور قابلتوجهي ميتواند بيـان پـروتئين در فاز محلول را افزايش دهد. بحث و نتيجه گيري: اين مطالعه نشان داد كاهش دما باعث كاهش بيان كلي پروتئين و همچنـين كاهش بيان در فاز محلول باكتري ميشود؛ اين امر ميتواند به علت مقاوم بودن آنـزيم تـرانس آمينـاز به دما باشد و با توجه به اينكه اين آنزيم از باكتري ترموفيل جدا شده است احتمالا دما در تاخوردگي صحيح پروتئين موثر ميباشد. در بررسي اثرغلظت IPTG بـر بيـان ايـن پـروتئين مشـخص شـد كـه غلظتهاي زياد IPTG تاثيري در روند بيان پروتئين ترانس آميناز ندارد در نتيجه ميتوان اين پروتئين را با غلظتهاي پايين IPTG هم توليد كرد كه از نظر اقتصادي مقـرون بـه صـرفه اسـت. نتـايج ايـن مطالعه نشان داد از ميان تركيبات شيميايي مورد استفاده در محيط كشت باكتري، سوربيتول احتمالا بـا پايداري مولكولهاي آب اطراف پروتئين مانع از دناتوره شدن پروتئين شده و ميتوانـد بيـان پـروتئين ترانس آميناز در فاز محلول را پس از گذشت 5 ساعت از افزودن القاگر به ميزان قابل توجهي افزايش دهد. در نهايت شرايط بهينه براي توليد آنزيم ترانس آميناز در دماي 37 درجه سانتيگراد و غلظـت 1 ميلي مولار IPTG بدست آمد.

عنوان انگليسی

Investigating the effect of temperature and concentration on the expression of transaminase enzyme in the IPTG solution phase Escherichia coli bacteria

خلاصه انگلیسی

Introduction: Transaminases are pyridoxal 5´- dependent enzymes that transfers an amino group from a donor to an acceptor substrate. Thus these enzymes play an important role in the Biosynthesis of compounds containing chiral amine units and amino acids. β-amino acids are major precursor to various drugs and other industrially important chemicals. The yields of recombinant protein in inclusion bodies are low as well as biological activity of misfolded protein. Therefore, soluble enzyme production in E. coli is important step in bio synthesis process. The aim of this study was to evaluate the effects of different concentrations of IPTG, molecular chaperones and temperature on soluble expression of recombinant Transaminase enzyme. Methods: In this study a Mutation of Transaminase enzyme gene was inserted into the pET28b vector using double restriction enzymes digestion and T4 DNA ligase. The recombinant vector transformed into the E. coli DH5α by treated CaCl2 bacteria and heat shock procedure. Colony-PCR was performed to confirm the correctness of the cloning process and the existence of the desired fragments in recombinant construct. The expression vector pET28b containing target protein was transformed into E. coli BL21 competent cells. The protein concentration was determined using the Bradford method and quantity of expression transaminase was analyzed by SDS- PAGE. Different temperatures, IPTG concentrations and chaperone molecules were used to increase the protein expression in the soluble phase, sorbitol, arginine, sucrose, glycine and tween were added to the bacterial culture medium as chemical chaperon molecule. Results: Investigation of Colony-PCR results on agarose gel confirmed the presence of transaminase gene in the transformed bacteria. Evaluation of different colonies showed that protein expression in colony 1 was significantly higher than other colonies. The study of temperature effect and IPTG concentration on the expression of protein showed that the effect of temperature on transaminase expression was higher than IPTG and the highest protein expression was performed 2 h after induction of expression at 37 ° C and 1 mM IPTG. Conclusion: This study showed decreasing temperature causes a decrease in protein expression as well as decreasing expression in the soluble phase. This could be due to the resistance of the transaminase enzyme to temperature and, due to the fact that this enzyme is separated from the thermophilic bacteria, the temperature is likely to be effective in the correct folding of protein. Investigating the effect of IPTG concentration on the expression of this protein, it was found that high concentrations of IPTG do not affect the expression of transaminase protein, so it can be produced with low concentrations of IPTG, which is economically less expensive. The results of the study showed that, among the used chemical compounds, sorbitol would probably inhibit protein denaturation by the stability of water molecules around the protein, and it could significantly increase the expression of the transaminase protein in the soluble phase after 5 hours of induction. Finally, optimum conditions for the production of transaminase enzyme were obtained at 37 °C and 1 mM IPTG concentration.

Document Downloads