بررسی بیان ژن¬های مسیر آپوپتوز در رده¬ی سلولی HL60 به دنبال مواجهه با نانوذرات Origanum vulgare

خلاصه فارسی

Origanum vulgare گیاهی چند ساله با خاصیت آنتی اکسیدانی بسیار بالاست که از غلظت بالایی از ترکیباتی فنلی برخوردار است. HL60 رده سلولی لوسمی پرومیلوسیت حاد (AML-M3) است. لوسمی پرومیلوسیت حاد اغلب حاصل یک جابجایی کروموزومی (q24;q21)(15;17)t و تشکیل انکوپروتئین PML-RARA است که طی آن فرایندهای آپوپتوز و تمایز در سلول-های پیش¬ساز میلوئیدی متوقف شده و سلول¬های میلوئیدی در مرحله پرومیلوسیت دچار تکثیر کنترل نشده می¬شوند. القای آپوپتوز و تمایز با داروهای (All-tranas retinoic acid)ATRA و (Arsenic Trioxide) ATO خط اول درمان این لوسمی هستند. ATO با افزایش ROS درون سلولی موجب القای آپوپتوز در سلول¬های لوسمیک می¬شود. در این مطالعه، برای بررسی تاثیر عصاره و نانوذرات Origanum vulgare بر روی مرگ رده¬سلولی HL60، ابتدا نانوذرات O.vulgare به روش سنتز سبز، سنتز گردیده سپس اختصاصیت و ویژگی¬های آن با تست¬های فیزیکوشیمیایی از جمله تصویر برداری SEM، آنالیز FTIR، طیف سنجی UV-VIS و تکنولوژی D.L.S بررسی گردید. جهت مطالعه پایه، عصاره Origanum vulgare به رده¬های سلولی HL60 و Nalm6 (لوسمی لنفوسیت B) اضافه گردید. با مشاهده IC50 کمتر در HL60، بقیه مطالعات بر روی رده¬سلولی HL60 ادامه پیدا کرد. نمودارهای وابسته به غلظت و زمان برای تاثیر Origanum vulgare و نانوذرات آن در رده¬سلولی HL60 بعد از تست سمیت سلولی (MTT) رسم شده و مقدار IC50 در هر گروه تعیین گردید. بیان ژن¬های مسیر آپوپتوز از جمله Caspase8، Caspase9، Bax، Bcl-2و همچنین بیان ژن مسئول تغییرات سطوح ROS، Nrf2 با تکنیک Real Time PCR مورد بررسی قرار¬گرفت. جهت تعیین مراحل مرگ سلولی از جمله آپوپتوز اولیه، آپوپتوز ثانویه و نکروز، سلول¬ها با رنگ اکریدین اورنج/ اتیدیوم بروماید رنگ¬آمیزی شدند و با میکروسکوپ فاز کنتراست از سلول¬ها عکس¬برداری شد. نتایج حاکی از تاثیر عصاره Origanum vulgare و نانوذرات آن بر القای مرگ سلولی در رده سلولیHL60 ¬ می¬باشد. تاثیر نانوذرات از عصاره بیشتر بوده و هردو ماده باعث به راه¬اندازی آپوپتوز در مسیرهای داخلی و خارجی شده¬اند که به نظر می¬رسد مسیر القایی دو ماده با یکدیگر متفاوت باشد. مراحل اپوپتوز اولیه، آپوپتوز ثانویه و نکروز در سلول¬ها وابسته به غلظت بررسی شده و تعداد هر یک از مراحل تحت تاثیر دو ماده متفاوت است.

عنوان انگليسی

Analysis of Apoptotic Genes Expression in HL60 Cells Exposure to Origanum vulgare Nanoparticles

خلاصه انگلیسی

Origanum vulgare is perennial herb with high antioxidant components. Acute promyelocytic leukemia (AML-M3) cell line, HL60 is used for AML-M3 in vitro investigations. Acute promyelocytic leukemia (APL) often arisen from chromosomal translocation between 12 and 17 chromosomes (t (q24:q21) (15:17)) and leading to PML–RARA fusion protein formation. Following PML- RARA formation, apoptosis and differentiation processes have been arrested in myeloid precursor cells and these cells undergo uncontrolled proliferation in promyelocytic stage. Apoptosis and differentiation induction with ATRA (all-Trans Retinoic Acid) and ATO (Arsenic Trioxide), is first line of APL treatment. ATO with induction of intracellular ROS production lead to cancer cells death. In oreder to investigation of the effect of Origanum vulgare extract and Origanum vulgare mediated silver nanoparticles on HL60 cells death, Origanum vulgare nanoparticles were synthesized using green synthesis method. Then, synthesized nanoparticles were characterized using physiochemical tests, such as SEM microscopy, FTIR analysis, UV- vis spectroscopy and D.L.S technology. For baseline study, HL60 and B lymocytic leukemia, NALM6 cell line, were treated by Origanum vulgare extract. Based on lower IC50 in HL60 cells, studies continued on HL60 cells. Dose and time dependent graphs for the effect of Origanum vulgare and its nanoparticles in HL60 cells after the cytotoxicity test, MTT and IC50 values determination were ploted in each groups. Then expression of the apoptotic genes, including Caspase8, Caspase9, Bax, Bcl-2 and Nrf2 which responsible of intracellular ROS levels, changes were investigated using Real time PCR. For analysis of cell death stages including ealy apoptosis, late apoptosis and necrosis, the cells were stained with Acridin orange/Ethidium bromide cell staining assay and shown with phase contrast microscope. The results indicate thet the Origanum vulgare and its nanaoparticles are effective in HL60 cells death. Origanum vulgare nanoparticles is effective than Origanum vulgare extract and both agents induced apoptosis in internal and external pathways. However, analysis of genes expressions have shown different apoptosis induction pathways with Origanum vulgare and Origanum vulgare nanoparticles. The stages of early and late apoptosis and necrosis is dose dependent and were different in Origanum vulgare extract and nanoparticles treated HL60 cells.

Document Downloads