بررسی تغییرات برخی از فاکتورهای آپوپتوتیک در سلول‌های سومایت جنین جوجه به دنبال هم‌کشتی با نوتوکورد

Persian Abstract

مقدمه : سومایتها توده هایی از سلولهای مزودرمی در طرفین لوله عصبی هستند که به دنده ها، مهره ها و عضلات تمایز می یابند. نوتوکورد نیز به عنوان مزودرم محوری در زیر لوله عصبی در محیط بدن سبب بقاء و تمایز سلول‌های سومایتی می شود. هدف از این مطالعه، بررسی نقش آنتی آپوپتوتیک نوتوکورد در محیط آزمایشگاهی به دنبال هم کشتی با سومایت جنین جوجه بود. مواد و روشها: پس از جداسازی سومایت‌ها و نوتوکوردها از جنین جوجه مراحل 7-12 سومایتی،. نوتوکوردها در قطرات آلژینات قرار داده شده و به نسبت 1:2 با سومایتها (2 عدد سومایت: 1 عدد نوتوکورد) در محیط کشت FBS10٪ DMEM/F12+ به مدت 2 ، 4 ، 6 ، 10 روز هم کشتی داده شدند. در گروه دوم سومایتها با محیط فراهم شده از نوتوکورد و در گروه کنترل نیز سومایتها بدون نوتوکورد کشت داده شدند. در نهایت میزان حیات و تکثیر سومایت‌های همه‌ گروهها به روش MTT و میزان بیان ژنهای مختلف به روش RT-PCR و سنجش فعالیت آنزیم Caspase2 به روش اسپکتروفتومتری مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج : درصد سلول‌های زنده بر اساس روز صفر سومایت‌ها در روز 2 برای گروههای سومایت همراه با نوتوکورد ، سومایت بدون نوتوکورد و سومایت حاوی CM به ترتیب 59٪ ، 3/51٪ و 1/64٪ بود ، برای روز 4 همانند ترتیب بالا 4/74٪ ، 2/28٪ و 3/51٪ و بعد از 6 روز هم‌کشتی درصد سلول‌های زنده به ترتیب 7/89٪ ، 8/53٪ و 9/35٪ برآورد شد. نتایج RT-PCR نشان داد که در گروه حاوی نوتوکورد Caspase2 بیان نشده و بیان Bcl2 نیز شدیدتر از سایر گروهها بود. در گروه سومایت حاوی نوتوکورد بیان بیشتر Pax1 همزمان با کاهش بیان MyoD مشاهده گردید. یافته های اسپکتروفتومتری نیز نشان داد میران فعالیت آنزیم Caspase-2 در گروههای سومایت حاوی نوتوکورد، سومایت بدون نوتوکورد به ترتیب فعالیت آنزیم2/1و5/1 برابر سومایت های روز صفر بود. نتیجه گیری: نوتوکورد در محیط آزمایشگاهی و در شرایط هم‌کشتی باعث بقا سلول‌های سومایتی و کاهش آپوپتوز می شود و در تمایز سلول‌های سومایتی به سلولهای اسکلروتومی نقش دارد .

Title

Changes of Apoptotic factors in chick embryonic somitic cells upon co-culturing with notochord

English Abstract

Introduction: The somites are spherical aggregation of mesodermal cells which are located on either side of neural tube. They differentiate into ribs, vertebrae and muscles. The notochord, as an axial mesoderm that is beneath the neural tube has a major role in in vitro somitic cell survival and differentiation. This study was aimed to investigate in vitro antiapoptotic role of chicken notochord upon co-culturing with somite. Methods: After isolation of notochord and somites from chick embryo (stages 7-12), the notochord was encapsulated in alginate beads. Then, the somites and notochord, as a 2:1 ratio (2 somites:1 notochord) were co-cultured for 2, 4, 6 and 10 days. The somites were also cultured with notochord-derived condition medium (CM). In the control group, the somites were remained untreated. All groups were cultured in DMEM/F12 + 10%FBs medium. Finally, survival and proliferation of somites, expression of apoptotic factors and caspase-2 enzyme activity in somitic cells were analyzed by using MTT, RT-PCR and spectrophotometry methods, respectively. Results: Percentages of viable somitic cells at day 2, normalized with these cells at day 0, for somite with notochord (S+N), somite with notochord-derived CM (S+NCM) and somite alone were 59%, 51.3% and 64.1%, respectively. After 4 days co-culturing, 74.4%, 28.2% and 21.3% of somitic cells showed to be alive in above mentioned groups, respectively while 89.7 %, 53.8 % and 35.9% of cells respectively survived at day 6. RT-PCR analysis showed caspase-2 was not expressed in S+N while Bcl-2 was up-regulated more than the other groups. The somitic cells in S+N expressed high Pax1 and low MyoD. Spectrophotometry also revealed that Caspase-2 enzyme acitivities in S+N and Somite alone at day 6 were 1.5 and 1.2. Conclusion: The notochord improves in vitro somitic cell survival and reduces its apoptosis. It also triggers somitic cells to diffentiate into sclerotomal cells.

Document Downloads