بررسی مسیر فعال سازی کسپاز به دنبال آپوپتوز القا شده با اسید رتینوئیک در سلول های بنیادی ماتریکس بندناف انسان

خلاصه فارسی

زمینه و هدف اسید رتینوئیک در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی مانند تکثیر، تمایز و مرگ سلولی نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات آپوپتوتیک اسید رتینوئیک بر سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون بند ناف انسانی، مطالعه مسیر فعال سازی کسپازها و گیرنده های درگیر در مسیر پیام رسانی اسید رتینوئیک بود. روش ها پس از جدا سازی سلول های بنیادی از ناحیه ژله وارتون بند ناف انسانی به روش کشت قطعه ای و ارزیابی نشانگرهای سطحی آنها با تکنیک های فلوسایتومتری و RT-PCR، منحنی رشد این سلول ها در پاساژهای اول تا پنجم تعیین و مدت زمان دو برابر شدن جمعیت آنها محاسبه شد. جهت بررسی اثرات آپوپتوتیک اسید رتینوئیک، سلول های پاساژ دوم به دو گروه با کشت اولیه 24 و 72 ساعت تقسیم شدند و هر کدام از این گروه ها چهار و شش روز تحت تاثیر غلظت های مختلف این ماده قرار گرفتند. همچنین تاثیر اسید رتینوئیک در پاساژهای مختلف و با تعداد متفاوتی از سلولهای بنیادی بررسی شد و در نهایت، میزان حیات سلول های بنیادی تیمار شده با اسید رتینوئیک به روش MTTارزیابی گردید. سپس ویژگی های مورفولوژیکی سلول های آپوپتوتیک با رنگ آمیزی EB/AO و DAPI و بیان ژن های دخیل در اپوپتوز و گیرنده های اسید رتینوئیک به روش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج سلول های بنیادی ژله وارتون در پاساژهای اول و دوم نسبت به پاساژهای سوم تا پنجم فاز سازش کوتاهتر و PDT کمتری داشتند. در سلولهای گروه کشت 24 ساعت، میانگین درصد حیات سلول هایی که تحت تیمار با اسید رتینوئیک قرار گرفته اند به صورت وابسته به غلظت کاهش یافت؛ اما مهار 50 درصدی حاصل نشد. در همین گروه با افزایش مدت زمان تیمار از چهار روز به شش روز نیز نتایج مشابهی حاصل شد. در گروه 72 ساعت کشت، اسید رتینوئیک تاثیر بیشتری نشان داد و در غلظت 7-10 مولار میانگین درصد حیات سلولها به 44% تقلیل یافت. افزایش تعداد زمان تیمار این سلول ها از چهار روز به شش روز نشان داد که این سلول ها نسبت به محدوده غلظت های فیزیولوژیکی اسید رتینوئیک (8-10- 10-10مولار) حساسیت بیشتری دارند و بیشترین حساسیت در سلول های پاساژ دوم با تعداد 1000 سلول در هر چاهک مشاهده شد. رنگ آمیزی های EB/AO و DAPI سیتوپلاسم حباب دار و هسته های آپوپتوتیک را در سلولهای تیمار شده با اسید رتینوئیک را نشان داد. آنالیز RT-PCR افزایش بیان ژن های گیرنده اسید رتینوئیک (RARα و RARβ) و نیز ژن های دخیل در آپوپتوز (Caspase3،Caspase8 ، Caspase9 و Bax) و کاهش بیان ژن ضد آپوپتوزی (Bcl-2) را در سلول های تیمار شده با غلظت 7-10مولار اسید رتینوئیک به اثبات رساند. نتیجه گیری سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون پاساژ دوم در فاز تکثیری رشد خود تحت تاثیر غلظت های 7-10 تا 5-10 مولار اسید رتینوئیک دچار آپوپتوز شدید شده و ژن های دخیل در آپوپتوز در آنها بیان می شوند. این اثر آپوپتوتیک اسید رتینوئیک توأم با افزایش سطح بیان گیرنده های آن در سلول های بنیادی ژله وارتون می باشد.

عنوان انگليسی

Caspase-activation Pathway upon Apoptosis Induced by Retinoic Acid in Human Umbilical Cord Matrix-derived Stem Cells

خلاصه انگلیسی

Abstract Background and aim: Retinoic acid,(RA) plays multiple roles in many biological processes such as proliferation, differentiation and cell death. This study was aimed to investigate apoptotic effects of RA on the human umbilical cord Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells and to study caspase activation pathways and receptors involved in retinoic acid signal transduction pathways. Methods: Following the isolation of stem cells from the Wharton's jelly of the human umbilical cord and evaluation of cell-surface markers by flow cytometry and RT-PCR techniques, growth curve of these cells through passages one to five was generated from which a population doubling time was determined. To study apoptotic effect of RA, cells from passage two were divided in two groups, one group initially being cultured for 24 hours and the other one for 72 hours. Then these two groups were treated with different concentrations of RA for 4 and 6 days. The effects of RA were also studied on stem cells at different passage numbers and with different densities. Finally, MTT assay was used to evaluate viability rate for RA-treated cells. Morphological characteristics of apoptotic cells were analyzed through EB/AO and DAPI staining methods. Using RT-PCR, expression of RA receptor genes and genes involved in apoptosis were analyzed. Results: Wharton's jelly derived-stem cells in passages 1 and 2 had shorter lag phase and less PDT compared to passages 3 to 5. In the 24-hour cell group, mean percentage of viability in cells exposed to RA was decreased in a dose-dependent manner. However, inhibitory concentration for 50% of the cells was not detected. In this group, the same results were observed through increasing the RA exposure from 4 to 6 days. In the 72-hour cell group, RA showed more profound effects and cell viability rate was decreased to 44% in 10-7 M of RA. More exposure time to RA from 4 to 6 days made these cells more sensitive to physiological levels of RA (10-10 - 10-8 M) and the most sensitive cells were those in passage 2 cultured at the density of 1000 cells per well. EB/AO and DAPI staining revealed blebbed cytoplasm and apoptotic nuclei in RA treated cells. RT-PCR analysis showed enhanced expression for retinoic acid receptor genes (RARα and RARβ), and genes involving apoptosis (Caspase3, Caspase8, Caspase9 and Bax) expression in cells treated with 10-7 M of RA but in contrast, expression of anti-apoptotic gene (Bcl-2) decreased. Conclusion: Exposure to 10-7 – 10-5 M of RA triggers extensive apoptosis and enhances RAR expression in proliferating Wharton's jelly-derived stem cells at passage two.

Document Downloads