تأثیر سرکوب بیان ژن hTERT بر بیان ژن TERRA در سلول AGS سرطان معده

Persian Abstract

مقدمه: تلومرهای تکرارهای توالی DNA در انتهای کروموزوم یوکاریوت ها هستند. تلومر ها نقش مهمی در حفظ پایداری ژنوم و جلوگیری از تخریب و از دست رفتن محتویات ژنتیکی انتهای کروموزوم دارند. تلومرها به ساختاری به نام TERRA رونویسی می شوند. TERRA یک RNA غیر کد کننده بلندایت که در تنظیم طول تلومر و فعالیت تلومراز نقش دارد. تلومر یک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس است که تکرار توالی TTAGGG را به انتهای کروموزوم ها می افزاید. آنزیم ریبونوکلئوپروتئینی تلومراز شامل یک زیر واحد پروتئین به نام به نام TERT و یک الگوی RNA به نام TERC می باشد. هدف از این مطالعه، تأثیر سرکوب ژن hTERT بر بیان ژن TERRA و طول تلومر در پاساژهای متوالی می باشد. مواد و روشها: سلول AGS سرطان معده توسط hTERT FlexiTube siRNA به مدت 36 ساعت تیمار شد. درصد بقای سلول با استفاده از روش MTT بررسی شد. رنگ آمیزی DAPI با استفاده از تکنیک Flow cytometry برای آنالیز چرخه سلولی انجام شد. بررسی بیان ژن های hTERT، TERRA و طول تلومر با استفاده از تکنیک Real-Time PCR انجام شد. نتایج: نتایج حاصل از تست MTT، کاهش بیش از 50 درصدی بقای سلولی را در زمان 48 ساعت نشان داد. آنالیز چرخه سلولی با استفاده از Flow cytometry افزایش درصد فاز G1 و کاهش فاز S را نشان داد. نتایج حاصل از Real-Time PCR با کاهش بیان hTERT در پاساژهای اولیه بر بیان TERRA تأثیر قابل ملاحظه ای را نشان نداد اما در پاساژ 20 افزایش بیان TERRA نسبت به سلول های کنترل مشاهده شد. طول تلومر پس از تیمار سلول توسط siRNA در هر پاساژ نسبت به سلول های کنترل کاهش یافت. نتیجه گیری: کاهش قابل ملاحظه بیان 48hTERT ساعت پس از تیمار منجر به کاهش درصد بقای سلولی و توقف چرخه سلولی میشود. در این مطالعه مشاهده شد که بیان TERRA در سلول AGS سرطان معده پایین می باشد و کاهش بیان hTERT در پاساژهای اولیه تأثیری در بیان TERRA ندارد و تنها در پاساژ 20 منجر به افزایش بیان TERRA شده است. همچنین در این مطالعه ارتباط بین کاهش بیان ژن hTERT با کاهش طول تلومر مشاهده شد. اما ارتباط معناداری بین بیان TERRA و طول تلومر مشاهده نشده است.

Title

The Effect of hTERT Repression on the TERRA Expression in AGS Cell Line of Gastric Cancer

English Abstract

Background and objectives: Telomeres are the repetitive DNA sequence found at the ends of eukaryotic chromosomes. These structures play a vital role in maintaining the integrity of the genome and prevent the loss of genetic material that resides near the ends of the chromosome. Telomeres have been considered to be transcriptionally silent, but it was recently demonstrated that mammalian telomeres are transcribed into telomeric repeat-containing RNA (TERRA). TERRA, a long non-coding RNA, participates in the regulation of telomere length and telomerase activity. Telomerase is a reverse transcriptase capable of adding TTAGGG repeats to the 3' ends of chromosomes. A ribonucleoprotein, the telomerase enzyme is composed of a catalytic protein subunit (telomerase reverse transcriptase, TERT) and an RNA component (telomerase RNA component, TERC). In this thesis, we studied the effect of hTERT repression on the TERRA expression and telomere length in multiple passages. Methods: AGS gastric cancer cell line was treated with hTERT FlexiTube siRNA and incubated for 36 hours. Cell viability was examined by MTT assay. A DAPI staining method was used to analysis cell cycle by Flow Cytometry. Real time PCR was used to quantitate the expression level of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT), TERRA expression and Telomere Length. Results: The MTT assay results showed increasing the exposure time to 48 hours decreased cell viability below the 50% viability mark. The flow cytometry cell cycle analysis showed a significant increased the number of cells in G1 phase and decreased the number of cells in S phase. The results of real-time qRT-PCR analysis demonstrated that downregulation of hTERT expression has no significant effect on TERRA expression in early passages, but siRNA treated cell in the passage of 20 shows a significant change in expression of TERRA compared to these control cell. Also telomere length measurement in each passage was decreased after hTERT siRNA treatment. Conclusion: The significant downregulation in hTERT mRNA after 48 hours of hTERT siRNA treatment inhibited the cell viability of AGS cells and cell cycle arrest. This study provides the low expressed of TERRA levels in AGS cell line and downregulation of hTERT expression had no effect on TERRA expression level in early passages of AGS cell line. Also, this study showing a direct link between decreased of telomere length and downregulation of hTERT expression.

Document Downloads