تاثیر سرکوب miR-1266-5p بربیان ژن hTERT و فعالیت تلومرازی در رده های مختلف سلولهای سرطانی

خلاصه فارسی

زمینه وهدف: آنزیم تلومراز مسئول افزایش طول تلومر می باشد و در 90% سلول های سرطانی وجود دارد. hTERT زیرواحد تنظیم کننده تلومراز است و نقش مهمی در فعالسازی تلومراز دارد. مکانیسمی که از طریق آن hTERT تهاجم و تومورزایی سرطان را تنظیم می¬کند، نامشخص است. میکروآرناها تنظیم کننده های جدیدی برای خاموش سازی ژنها هستند و می توانند بیان ژن hTERT را بوسیله اتصال به مناطق 3′UTR آن تنظیم کنند. در مطالعه ای هدف قرار دادن hTERT توسط میکروآرنای 1266 در رده سلولی SGC-7901 سرطان معده گزارش شده است. از آنجایی که نقش miR-1266 بر روی ژن hTERT در رده های سلولی سرطانی دیگر بررسی نشده است، بنابراین در مطالعه حاضر، نقش miR-1266-5p بر روی بیان ژن hTERT و رونوشت های مختلف آن، فعالیت تلومرازی، بقاء سلولی و تغییرات چرخه سلولی در رده های سلولی سرطان معده (AGS)، سرطان پستان (MCF7)، سرطان کبد (HepG2) و ملانوما (A375) مور بررسی قرار گرفت. روش بررسی: در این مطالعه رده های سلولی AGS، MCF7، HepG2 و A375 در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10% سرم و 1% آنتی بیوتیک کشت داده شدند. سلولها با miR-1266-5p mimic، miR-1266-5p inhibitor و HiperFect reagent به تنهایی (به عنوان کنترل منفی) تیمار شدند. میزان بیان miR-1266-5p و hTERT توسط Taqman qRT-PCR اندازه¬گیری شد. میزان بیان رونوشت¬های مختلف hTERT با SYBerGreen qRT-PCR بررسی شد. بقاء سلولی و تغییرات چرخه سلولی به ترتیب بوسیله MTT و فلوسایتومتری انجام شد. همچنین برای اندازه گیری فعالیت تلومراز از TRAP Assay کیفی استفاده شد. نتایج: نتایج Real Time نشان داد که میزان بیان miR-1266-5p در سلول های تیمار شده با mimic در مقایسه با سلول-های کنترل افزایش می یابد، در حالیکه در سلول های تیمار شده با inhibitor کاهش می¬یابد. افزایش بیان miR-1266-5p باعث کاهش بیان hTERT می شود و مهار miR-1266-5p بیان hTERT را افزایش می دهد. همچنین افزایش بیان miR-1266-5p بیان رونوشت Full-length و آلفا را به ترتیب کاهش و افزایش می دهد. نتایج MTT نشان داد که افزایش بیان miR-1266-5p بقاء سلولی را کاهش می¬دهد، در حالی که مهار آن بقاء سلولی را افزایش می دهد. نتایج فلوسایتومتری نشان داد که تعداد سلولها در سلول های تیمار شده با mimic در فاز G1 افزایش و در فاز S کاهش می یابد. در حالیکه تعداد سلولها در سلولهای تیمار شده با inhibitor در فاز G2/M افزایش می یابد. نتایج TRAP Assay کیفی نشان داد افزایش بیان miR-1266-5p فعالیت تلومرازی را سرکوب می کند. نتیجه گیری: براساس نتایج بدست آمده، miR-1266-5p می تواند بیان hTERT و فعالیت تلومرازی را در رده های سرطانی سرطان معده (AGS)، سرطان پستان (MCF7)، سرطان کبد (HepG2) و ملانوما (A375) هدف قرار دهد و به عنوان سرکوب کننده hTERT و فعالیت تلومرازی عمل کند. همچنین miR-1266-5p باعث کاهش بقاء سلولی و توقف چرخه سلولی می شود، در حالیکه مهار miR-1266-5p اثرات معکوس دارد. علاوه بر این، miR-1266-5p می تواند بیان رونوشت¬های مختلف hTERT را در سلولهای AGS تغییر دهد و منجر به کاهش بیان hTERT شود. بنابراین می توان نتیجه گرفت انتقال miR-1266-5p به سلولهای AGS، MCF7، HepG2 و A375 می تواند ابزار درمانی مناسبی برای درمان سرطان های معده، پستان، کبد و ملانوما باشد.

عنوان انگليسی

The effect of hsa- miR-1266-5p suppression on the hTERT gene expression and telomerase activity in cancer cell lines

خلاصه انگلیسی

Background and Objective: Telomerase is in charge of telomere extending. It is triggered in about 90% of cancer cells. hTERT is the controlling subunit of telomerase and plays a critical role in the activation of telomerase. The mechanism through which hTERT regulate the invasion and metastasis of cancer is unclear. miRNAs are the novel regulator of gene silencing and can target hTERT by binding the 3’ UTR of its mRNA, and regulate gene expression. In the previous study reported that miR-1266 can target hTERT in gastric (SGC-7901) cancer. In this study, we have made the first report of miR-1266-5p role on the hTERT expression, its various transcripts, telomerase activity, and biological functions, including cell proliferation and cell cycle in AGS, MCF7, A375, and HepG2 cells. Methods: For investigating the function of miR-1266-5p, we used chemically synthesized oligonucleotide mimics and inhibitors. AGS, MCF7, A375, and HepG2 cells were transfected with miR-1266-5p mimic, inhibitor, and just HiperFect reagent as a negative control. The Expression levels of miR-1266-5p, hTERT, its variant transcripts, and transfection efficiency were analyzed by Taqman qRT-PCR. The cell proliferation and cell cycle changes were detected by MTT calorimetric assay and flow cytometry, respectively. Also, Quantitative TRAP Assay was used to detect telomerase activity. Results: The results showed that the expression of miR-1266-5p significantly was increased after transfection by mimic compared to control cells, while its expression was decreased in transfected cells by the inhibitor. Also, we confirmed that upregulated miR-1266-5p significantly decreased cell growth, although inhibitor promoted cell proliferation. This finding was confirmed by cell cycle analysis, as upregulation of miR-1266-5p induced cells cycle arrest at the transition of G1 to S phase and led to G0/G1 entry, while the downregulation of miR-1266-5p promoted cell growth and led to G2/M entry. Concordantly, the overexpression of miR-1266-5p resulted in down-regulated hTERT expression and also suppressed telomerase activity. Also, upregulation of miR-1266-5p decreased full-length variant and increased alpha variant compared to transfected cells by inhibitor and control cells. Conclusion: our results demonstrated that miR-1266-5p can target hTERT expression and telomerase activity in the Gastric (AGS), Breast (MCF7), Liver (HepG2), and Melanoma (A375) cancer cell lines, so acts as hTERT and telomerase activity suppressor. miR-1266-5p could also decrease cell proliferation and induce cell cycle arrest, while its inhibition eliminates miR-1266-5p effects. In addition, miR-1266-5p can affect hTERT variants in AGS cell line and alter their expression as well as result in downregulate of hTERT expression. Thus, upregulation of miR-1266-5p may be a serve as a novel therapeutic target in AGS, MCF7, A375, HepG2 cell lines. Thus, delivery of miR-1266-5p to these cells can be an effective therapeutic target for the treatment of Gastric, Breast, Liver, and Melanoma cancers.

Document Downloads